2010-08-22 00:00
    啤酒泡沫是消费者在选择和消费啤酒时所要考虑的重要因素之一，也是啤酒酿造工业用来衡量啤酒质量的重要指标(Leisegang and Stahl, 2005)，品质优良的啤酒通常具有优良的泡沫特征。啤酒的泡沫性能包括起泡性、泡沫稳定性、泡沫附着力和泡沫外观等四个方面。
1.啤酒泡沫的物理特性
    物理学的因素对啤酒泡沫具有重要的影响。有研究表明（董建军等，2004），用氮气的核化作用能够促进小气泡的产生，会使正常啤酒乃至二氧化碳低的啤酒形成良好的泡沫。Jackson（1978）认为，在恒定的温度且不加外力的条件下，CO2释出的速度取决于形成气泡的晶核数量。泡沫体积与CO2释出速度有一定的关系。Ronteltap等（1991）对啤酒气泡的形成、排水、聚结及不对称或失衡做了比较系统的研究后认为，气泡形成的关键是晶核形成作用，当啤酒暴露于正常的气压时，CO2处于过饱和状态，有足够的能量形成新表面，由于自发性形成均匀的气泡核，同时伴随压力的释放，微小气泡逐渐膨大而上浮，最终形成啤酒的泡盖。排水是指液体从泡沫中向下流向酒液的过程。重力作用是排水的主要推动力。另外，在多面体的泡沫中，Plateau边界（泡沫之间的薄膜交界处所形成三角形液柱）吸力对排水也起到推动作用，由于Plateau边界的弯曲，其边界的中间压力要比气泡中间和平面膜中的压力要低，导致啤酒酒液从气泡膜流向Plateau边界，再由重力作用，使酒液从泡沫中流出。排水作用使气泡间的液膜变薄，直接造成啤酒泡沫的聚结和失衡。泡沫的聚结可能会造成泡沫膜表面的粗糙化或者发生崩解。膜表面的粗糙化是由发生在泡沫层内部的聚结导致的，聚结会产生大气泡，使气泡总数量减少，上层泡沫膜崩解，最后导致泡沫的减少甚至消失。气泡间发生气体扩散形成气泡间的气压差，使得泡沫膜表面粗糙化，会造成泡沫的失衡作用。
    同样地，Bamforth（2004）将啤酒泡沫的形成和泡沫持续过程中的物理事件归纳为四个方面，即泡沫形成、泡沫增加、失衡和排水。并且认为这些方面并不是彼此独立的，比如排水的程度会影响失衡发生的趋势。尽管啤酒中的CO2是过饱和的，气泡也并不会自发形成（Prins and Marle, 1999），必须有晶核的存在。颗粒、杯子上的划痕或者预先形成的微小气泡都能起到晶核的作用，影响产生的气泡的大小的因素可以用以下公式来描述：
 
其中，
r=产生的气泡的半径；
Rm=晶核半径(m)；
γ=表面张力(mN m-1)；
ρ=啤酒相对密度(kg m-3)；
g=重力加速度(9.8m s-2)。
对于啤酒气泡的释放和上升的速度，Bamforth（2004）总结： 

           
其中，
v=气泡上升的速度；
g=重力加速度(9.8m s-2)；
ρ=啤酒密度(kg m-3)；
r=气泡的半径；
η=啤酒黏度(Pa s)。
排水作用与泡沫的形成是同步的，排水的物理学参数可以由以下方程表示（Walstra, 1989）：
                               
其中，
Q=排水速度(m3 s)；
η=液膜的黏度(Pa s)；
ρ=啤酒密度(kg m-3)；
q= Plateau边界长度(m)；
g=重力加速度(9.8m s-2)；
δ=膜的厚度(m)。
对于泡沫稳定性的影响，失衡的作用要比泡沫聚结的作用更加显著(Ronteltap, 1989)，泡沫的失衡可以由De Vries方程加以描述：                                         
                               
其中，
 =气泡的瞬时半径；
 =气泡的初始半径；
R=气体常数(8.3 J K-1 mol-1)；
T=绝对温度(°K)；
D=气体扩散系数(m2 s-1)；
S=气体的溶解度(mol m-3 Pa-1)；  
γ=表面张力(mN m-1)；
t=时间(s)；
P=压力(Pa)；
 =气泡间液膜厚度(m)。
     液体的表面张力阻碍着泡沫的形成，因而啤酒中的表面活性物质的存在在一定程度上降低了酒液的液体表面张力，起到促进啤酒形成泡沫的作用。同时啤酒泡沫的产生大量增加了液体的表面积，这样就会消耗一定的能量来对抗阻止泡沫形成的液体表面张力。这些能量是通过气体进入液体后引起的湍流和鼓泡的机械作用而获得的。所以从能量的角度考虑，泡沫的形成会造成啤酒体系的Gibbs (吉布斯)自由能增加（Dale et al., 1999）。所有的泡沫都会处于热力学的不稳定状态，而泡沫的塌陷会使其回复到原初的能量状态。这种热力学不稳定性也可以得到来自于部分物理的或者自身化学组成的因素的改善，尤其是在泡沫形成过程中气-液面吸收的表面活性分子减小了表面张力，使新形成的表面能够达到稳定的状态。
2.啤酒泡沫的化学分子特性
    啤酒泡沫的化学分子特性主要是由啤酒酒液内部的活性物质和化学分子所决定的。对于特定的啤酒体系来说，其泡沫的稳定性受其内部分子性质的显著影响（Clark et al., 1989）。啤酒泡沫被广泛看作是由蛋白形成的泡沫体系，这个体系由来自制麦和酿造过程中溶解以及酶解的谷物蛋白所产生的多肽构成主要的泡沫稳定物质（Christopher et al., 1989）。
    啤酒中的蛋白质是构成泡沫的基本骨干的理论早已成为定论。具有有效的表面活性作用的蛋白必须满足两个条件（Dickinson,1989，Dickinson et al., 1988）：1.能够进入气泡壁；2. 其分子构象能够在气泡壁内发生去折叠，同其它分子（如异-α-酸）相互作用，同时在气泡壁内具有可移动性，能够调整气泡壁的厚度。具有较好的泡沫稳定作用的蛋白必须能够被气泡表面快速吸收和去折叠，并且能够形成牢固的、柔韧的、粘性的膜，有效减少气泡内的气体渗出，从而阻止气泡间的聚结和失衡。具有良好起泡性能的蛋白质都具有较好的柔韧性和双亲性以及相对较小的分子量（Bamforth, 2004）。蛋白质在其等电点时具有最强的泡沫稳定性，因为此时蛋白不带有静电荷，使得静电脉冲和水化作用最小。Clark等（1989）通过对位于气-液界面的球蛋白特性的广泛研究来理解蛋白质的泡沫稳定作用。然而由于受啤酒的不均一性和多肽片段的影响，使得对于这些物质相似性的详细的分析受到了限制，当时有关啤酒泡沫性质的分析和预测也只局限于对泡沫稳定性和酒液内多肽总量的测量之间的相互关系上（Dale and Young, 1987）或者是对来自酒液或塌陷的泡沫的多肽片段粗液的性质测定，如分子量（Dale and Young, 1987）或疏水性（Glenister and Koeppl, 1967）。
3.啤酒的化学成分及其对泡沫的影响
    啤酒的泡沫质量受控于其中的一系列对泡沫的形成和稳定具有积极或消极作用的化合物（Bamforth, 1985）。啤酒泡沫主要是由泡沫阳性蛋白、二氧化碳、β-葡聚糖、来自酒花的苦味物质、类黑素和金属离子等构成（Evans et al., 1999; Lusk et al., 1995; Narziß, Reicheneder and Barth, 1982; Simpson and Hughes, 1994）。其中，二氧化碳、泡沫阳性蛋白和异葎草酮（Simpson and Hughes, 1994）是构成啤酒泡沫的三大要素。泡沫阳性蛋白、酒花树脂等表面活性物质可以降低啤酒液体表面张力，因此有助于形成更多的泡沫；异-α-酸的表面粘度高，有助于泡沫的持久和挂杯；亲水性多糖可以提高泡沫的坚固性；金属离子的作用是对泡沫的持久性起保护作用（Lusk et al., 1995）；苦味酸在最大程度上增加了天然未变性蛋白的泡沫稳定性能，苦味酸具有泡沫稳定剂作用的部分原因是由于其能够使与之作用的多肽发生变性（Kapp and Bamforth, 2002）。
    通过人们对啤酒泡沫多年的研究，啤酒中的蛋白和多肽对泡沫的产生和稳定起关键作用的观点已被广泛认同（Bamforth, 1985; Evans and Sheehan, 2002）。很多研究者试图确定对啤酒泡沫具有影响的多肽的性质（Kordialik and Ambroziak, 2004）。然而啤酒多肽由大量的具有不同分子量和疏水性的分子所组成，这使得分离这些多肽变得极为困难。具有最强的疏水性的多肽产生最稳定的啤酒泡沫，并且多肽的疏水性对啤酒泡沫所起的作用比分子大小更重要的观点已被广泛接受（Bamforth, 1995; Slack and Bamforth, 1983）。但是，也有研究表明一定分子大小的多肽对泡沫稳定性具有最大的影响潜力（Maeda et al., 1991; Lusk et al., 1995）。除此之外，啤酒中的乙醇对泡沫的形成和稳定起着抑制作用（Brierley et al., 1996）。
    虽然啤酒中也存在酵母多肽，但是这部分来自于酵母的多肽含量非常少（Laemmli, 1970），对啤酒泡沫的影响很小。因此，大部分的泡沫阳性蛋白来源于麦芽汁（Kordialik, 2004），包括大麦醇溶蛋白（Kauffman et al., 1994; Dale et al., 1989）和清蛋白（Hejgaard, 1977）, 其中很多在制麦和发酵过程中都受到了广泛的修饰，包括蛋白酶水解和热变性，从而形成了啤酒中从几千Da到40KDa的分子量不等的蛋白和多肽（Onishi and Proudlove, 1994）。Kordialik等（2004）通过实验发现，泡沫中疏水性多肽的浓度是发酵麦汁中总肽浓度的两倍以上，泡沫多肽表现出相同程度的疏水性和非疏水性，非疏水性多肽在新鲜麦汁和发酵后的麦汁中占绝大部分，而在麦汁发酵中却只有很低的含量。
    虽然清蛋白和大麦醇溶蛋白都是泡沫阳性蛋白，但是清蛋白对泡沫的稳定作用要比大麦醇溶蛋白高一些（Kapp and Bamforth, 2002）。对泡沫阳性蛋白的变性都会提高其泡沫稳定性能，尤其是热变性作用，然而热变性对清蛋白泡沫性能的提高要大于对大麦醇溶蛋白泡沫性能的提高。清蛋白对半胱氨酸蛋白酶家族的无花果蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解都具有抗性，但是可以被丝氨酸蛋白酶家族的胰蛋白酶所水解。大麦醇溶蛋白对于胰蛋白酶的消化具有抗性，而对无花果蛋白酶和木瓜蛋白酶敏感。另外，尽管乙醇的存在对泡沫稳定性具有负面影响（Brierley et al., 1996）。但事实表明，乙醇的存在却可以提高未被变性的清蛋白的泡沫性能（Kapp and Bamforth, 2002）。
    由于来源于大麦清蛋白的Z4-蛋白（Hejgaard, 1977）和脂转移蛋白（LTP1，Sørensen et al., 1993; Bech et al., 1995）在制麦和发酵过程中其分子基本上保持完整，目前认为是对啤酒泡沫稳定性贡献最大的两种啤酒多肽，也是研究得最为深入的两种泡沫阳性蛋白（Mills et al., 1998）。这两种蛋白在制麦和发酵过程中都具有热稳定性，并且对水解酶和极端pH都具有抗性。
4.发酵菌种和生产原料对啤酒泡沫的影响
    选用优良的酵母菌株对于改善啤酒的泡沫性能具有重要的作用。酿酒酵母蛋白酶A是影响啤酒泡沫性能的关键性因素，同时不同的酵母菌种产生蛋白酶A的活力不同，如上面发酵酵母产生的蛋白酶A的活力高于下面发酵酵母，酵母染色体倍数越高，产生蛋白酶A的活力越高，三倍体高于单倍体和二倍体。因此，在选择纯生啤酒酿造菌株时，为了避免所酿制的啤酒的泡沫衰减，应尽量选择蛋白酶A活力较低的酵母菌株（王肇悦，2006）。Omrod等（1991）、Muldjberg等（1993）和Kondo等（1995; 1997）也都认为蛋白酶的活性与酵母菌株本身直接相关。Kondo等（1998）利用2L发酵罐对14株不同的酵母菌株进行了研究，当发酵条件完全相同，接种的酵母活力一致的情况下对这14株酵母产生蛋白酶A的能力进行比较后发现，不同的酵母菌株产生的蛋白酶A的能力不同。相应的二代、三代或更高代数的酵母产生的蛋白酶A是最初使用的酵母的2-3倍。
     酿造原料对啤酒泡沫具有重要的影响。要保证麦汁中含有足够的起泡蛋白，麦芽蛋白质含量应该在9%-12%。蛋白质溶解度应保证在40%以上，麦芽的溶解不良势必会给糖化带来困难，麦汁蛋白不足，β-葡聚糖分解不良，不仅会降低啤酒的泡沫质量，而且会使麦汁过滤困难。因此，应根据各种麦芽的酿造性能合理搭配，使麦汁中的起泡蛋白和糖蛋白聚合物达到最佳。Ishibashi等（1997）采用ELSA方法证实麦汁中泡沫阳性多肽的含量波动主要源于大麦中泡沫阳性蛋白含量的不同。同种大麦泡沫阳性蛋白的差异是受品系、生长地的气候、栽培技术等条件的不同影响的。同时，使用部分谷类原料可以增加啤酒中糖蛋白的含量，从而改进啤酒的泡沫性能。由于小麦富含糖蛋白，因此以小麦作为辅助原料时啤酒的泡沫性能会得到增强。使用玉米作为辅料时，必须事先对玉米进行脱胚处理，因为玉米胚富含对啤酒泡沫具有破坏性作用的油脂，而且容易使啤酒产生异味。通过生产发现，脱胚玉米的脂肪含量应控制在1.5%以下，最好不超过1%，这样使脱胚玉米作为酿造啤酒的辅料对改进啤酒泡沫的性能就会起到较大的作用。大米含有丰富的糖蛋白，用大米作为辅料有利于泡沫质量的提高。糯米优于粳米，粳米优于籼米。陈米中的脂肪会氧化为不饱和脂肪酸，不能通过过滤去除，会降低啤酒的泡沫性能。酒花的保存应在低温、干燥、避光防潮和隔绝空气的环境下，因为氧化和陈化的酒花中会含有较多的陈化物质和较高的单宁，在麦汁煮沸过程中影响蛋白质的区分和糖蛋白的形成以及异α-酸及其衍生物的生成，最终影响到啤酒的口味和泡沫质量。
5.生产工艺对啤酒泡沫的影响
     啤酒的生产工艺对啤酒的泡沫性能具有很大的影响。在麦芽干燥过程中会形成类黑素物质，类黑素具有胶体特征，有利于啤酒的起泡性和泡持性。形成类黑素的反应条件，除了应具备低分子糖类和某些含氮物质外，麦芽的水分不应低于5%，干燥温度在80°C -90°C时开始有此反应，形成类黑素的最适干燥温度为100°C -110°C，最适pH值为5.0。此外，适当延长麦芽干燥时间和提高麦芽干燥温度有利于形成大量的类黑素物质，从而增进啤酒的泡沫性能。酒花经过煮沸后部分α-酸转变为异α-酸，异α-酸不仅可以使啤酒具有良好的苦味和防腐能力，同时还能增进泡沫的持久性。过分延长麦汁的煮沸时间会导致α-酸和异α-酸含量的降低，从而影响啤酒的泡沫性能。因此在实际生产中，煮沸时间控制在1.5-2.0小时效果会更好。在麦汁的过滤过程中，麦汁的过滤一定要澄清，且麦醪的洗涤要适当，否则麦汁中会带入大量的脂肪酸而影响到啤酒的泡沫性能，并且脂肪酸对泡沫挂杯的影响比对泡持性的影响更为严重（冯林春，2001）。冷却麦汁通风时会产生泡沫，形成的泡沫不容易重新溶入麦汁中，从而造成异α-酸和泡沫阳性蛋白的不可逆损失，因此通风要适量或方式要得当。高温发酵会使pH值下降迅速，伴随着快速生成的二氧化碳产生较高的泡沫，蛋白胶体和苦味物质强烈分离，使泡沫质量变差。
    啤酒过滤时的温度和压力也会对泡沫产生直接的影响。清酒罐的背压也要根据滤酒的温度、压力和二氧化碳的含量进行调整，如果开始时背压偏低，则容易造成清酒进入清酒罐时处于非平稳状态，此时会产生大量的泡沫，从而影响到成品啤酒的泡沫性能。此外，杀菌对啤酒泡沫也有很大的影响。一方面热处理杀菌过程中可以灭活蛋白酶A，有利于啤酒泡沫的提高；另一方面，如果杀菌时间过长则会降低啤酒的泡持性。
6.与啤酒泡沫相关的主要的蛋白和蛋白酶
    在影响啤酒泡沫稳定性的众多因素中，泡沫阳性蛋白和对泡沫阳性蛋白具有降解作用的蛋白酶类被认为是啤酒泡沫稳定性的最主要影响因素，也是目前人们研究得最多、认识最深刻、最全面，同时也是在诸多影响因素中最为复杂的部分。其中，目前被学术界公认的对啤酒泡沫稳定性最具有影响力的蛋白为大麦Z-蛋白、大麦脂转移蛋白1（LTP1）和酿酒酵母蛋白酶A（Saccharomyces Cerevisiae  Proteinase A）。
6.1  Z-蛋白
    Z-蛋白是大麦丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中的一个成员（Dale et al., 1996），是大麦胚乳中的一种重要的蛋白。该蛋白有两种异构体，即Z4-蛋白和Z7-蛋白，pI值范围为4.5-5.5，其中Z4-蛋白和Z7-蛋白的比例约为4：1（BSZ4约占80%，BSZ7约占20%），Z4-蛋白由大麦第四号染色体上的长度为3133bp的Paz1基因所编码，共有399个氨基酸残基，其DNA编码序列内部含有一个334bp的内含子序列（1497-1830bp），分子量为43128Da（Brandt, 1990），与其它的丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员在相同位点上的相似性为25-30%，其中Z4-蛋白和Z7-蛋白的同源性为70%。Z7-蛋白的分子量约为39KDa（Lundgard and Svensson, 1989），由大麦第七条染色体上至少两个基因所编码。
    Z-蛋白在啤酒中同时具有相同程度的疏水性和亲水性。Z4蛋白在Z蛋白中含量远远高于Z7-蛋白，对于啤酒泡沫稳定性起作用的也主要是Z4-蛋白（Leiper et al., 2003）。Z4-蛋白是在发育的胚乳中以无信号肽的形式合成的，Z4- mRNA转录后均匀地分散到胚乳细胞的游离的和膜边界的多核糖体中，由21个氨基酸残基（36-56氨基酸残基）组成的内部疏水区作为信号将翻译的多肽介导定位到内质网腔中。第七号染色体上的等位基因Lys1和Lys3a分别能够增强和抑制Z4-蛋白的基因的表达（Brandt, 1990）。当给处于颖果时期的大麦提供一定量的氮肥时，Z4-蛋白的合成量就会增加。Z4-蛋白对于萌芽早期由糊粉层和胚鳞组织合成分泌的蛋白酶具有抗性（Hejgaard, 1978）。最初从啤酒中分离得到的Z4-蛋白是一种分子量大约为40KDa的多肽（Hejgaard and Kaersgaard, 1983）。
    通过对大麦Z4-蛋白的序列比较分析发现，其氨基酸残基Phe200、Phe/Met212、Phe374、Leu375、Phe/Met376、Phe388、Gly390、Val392和Pro395高度保守，构成分子内部疏水区域。对于Z4-蛋白C末端180个氨基酸残基的部分肽段和cDNA序列分析表明，这种蛋白和丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员α1-蛋白酶抑制剂、α1-胰凝乳蛋白酶抑制剂、抗凝血酶因子Ⅲ和卵清蛋白具有明显的相似性（Hejgaard et al., 1985）。目前，大麦Z4-蛋白的生物学功能还是未知的，但不排除这种蛋白可能能够抑制某种未知的酶。由于一些低分子量的蛋白酶抑制剂（如：胰蛋白酶抑制剂、胰凝乳蛋白酶抑制剂和枯草杆菌蛋白酶抑制剂）作为害虫入侵的防御，在大麦种子内都很丰富，因此Hejgaard等（1985）推测大麦Z4-蛋白可能具有特殊的生理学作用。
     曾有研究（Yokoi, 1989）表明，由于Z-蛋白的理化性质作用，浓度为50–200 mg/L的Z蛋白是啤酒中的主要的泡沫成分。后来的进一步的研究（Sørensen, 1993; Douma, 1997; Evans, 1995）证实，Z-蛋白的泡沫稳定作用是由于其与其他蛋白和泡沫阳性物质作用的结果。有研究者去除了啤酒中的40KDa的蛋白，但是仅引起啤酒泡沫稳定性很小幅度的下降（约10%），也有研究者去除了麦汁中分子量30KDa以上的蛋白，但却导致啤酒泡沫稳定性的大幅下降（约70%）（Kordialik and Ambroziak, 2004）。Slack and Bamforth（1983）报道，泡沫稳定性最好的蛋白质也是疏水性最强的蛋白质，而Yokoi（1994）通过疏水作用层析研究发现，尽管Z-蛋白相对疏水，但其在最疏水的部分中所占比例较小，这与以上报道似乎存在矛盾。但Evans等（1999）研究发现Z蛋白的主要异构形式——Z4-蛋白与反映蛋白水解程度的Kolbach指数（KI）呈现负相关。因此Evans等认为Z-蛋白的泡沫稳定和酶抑制双重作用可以解释其对泡沫影响的不确定性，因为Z4-蛋白的活性位点会在麦芽制造过程中被切割（Evans and Hejgaard, 1999）,然后成为自杀性蛋白酶抑制剂（Dale et al., 1996）。Z4蛋白的这种功能可能是通过泡沫稳定性相关的其他蛋白如大麦醇溶蛋白的过度水解来实现的（Kauffman et al., 1994; Sheehan and Skerritt, 1997）。因此，Z4-蛋白作为蛋白酶抑制剂在稳定泡沫中发挥着重要作用。Hejgaard等（1983）、 Brandt等（1990）和Dale等（1996）认为Z-蛋白在制麦和发酵过程中不被水解酶所降解是由于其部分与丝氨酸蛋白酶抑制剂具有同源性的原因。根据Hejgaard（1977）、Kaersgaard and Hejgaard（1979）、Lindorff-Larsen and Winter（2001）和Sørensen等（1993）的报道，大麦Z4-蛋白具有热稳定性，并且在制麦和发酵过程中不容易被水解酶类所降解。Hao等（2006）通过对啤酒及泡沫中的大麦Z4-蛋白的凝胶电泳分析发现除了具有Z4-蛋白本身的大约40KDa的条带外，还有一条对应分子量为7-17KDa的条带，质谱检测确定该条带是Z4-蛋白的水解产物，对应位置的肽段序列'ISYQFASSLLR'，恰好是Z4-蛋白中间靠近C末端的291-302氨基酸残基。由此推断，在发酵过程中至少有部分Z4-蛋白受到了蛋白酶的水解。
6.2脂转移蛋白1(LTP1)
    脂转移蛋白1（LTP1，也叫PAPI，是“putative protease amylase inhibitor”的缩写）是大麦糊粉层清蛋白中的一种蛋白质，广泛存在于植物界，其编码基因为Ltp1(1487bp)，氨基酸残基数为117，成熟肽氨基酸残基数为91（Linnestad et al., 1991），分子量约为9.7KDa。目前已获得很多这类蛋白的序列，这些蛋白具有非特异性脂类的膜间转移增强功能，因此被命名为非特异脂转移蛋白(NsLTP)。
植物脂转移蛋白不仅可以从脂质体运输磷脂酰胆碱（PC）到线粒体，也可以运输磷脂酰肌醇（PI）和较少量的磷脂酰甘油（PG）及半乳糖酯，但是不能运输三酰甘油（Nishida and Yamada, 1985）。
    非折叠和糖基化形式的大麦非特异脂转移蛋白能够控制啤酒泡沫的形成。二级结构和半胱氨酸配对表明，非特异脂转移蛋白和类黑素具有相类似的空间折叠特性。目前已经研究过的植物非特异脂转移蛋白与相应的动物和酵母的脂转移蛋白在结构和功能上都不具有相似性（Douliez et al., 2000）。尽管对植物脂转移蛋白三维结构和其基因调控的认识不断加深，但其生物学性质目前依然是未知的。疏水的LTP1在啤酒中的浓度为50-90mg/L，尤其集中于啤酒泡沫中（Bech et al., 1995; Sørensen et al., 1993; Vaag et al., 1999）。LTP1的二级结构由α螺旋组成。C-末端序列分析表明其结构由四个二硫键所稳定（Heinemann et al., 1996）。对植物nsLTP1三维结构的检测显示，这些蛋白具有一种共同的折叠方式，其结构由四个二硫键所稳定，具有由一个长的C末端臂覆盖的四螺旋束，位于蛋白中心的疏水侧链的松散折叠可以产生空穴，能够键合不同类型的单酰化和完全酰化的脂分子。这种空穴已经在大麦、小麦、玉米和水稻的nsLTP1中被发现。（Heinemann et al.,1996; Gincel et al., 1994; Shin et al., 1995; Chavolin et al., 1999; Gomar et al., 1996; Lee et al., 1998）。基于对小麦脂转移蛋白的核磁共振、红外光谱和拉曼光谱的研究（Désormeaux et al., 1992; Simorre et al., 1991）证实这种蛋白主要是由螺旋结构组织起来的，这些螺旋结构由二硫键相连接。  
    NsLTP1具有水溶性和热稳定性，并且在空气-水分界面具有表面吸附活性（Subirade et al., 1995）。如同Z-蛋白，LTP1与蛋白酶抑制剂具有同源性，是半胱氨酸内酶的抑制剂（Jones, 2000）。清蛋白对能够水解醇溶蛋白的半胱氨酸蛋白酶具有抗性，而且能够使麦汁中的半胱氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶失活（Jones and Marinac, 1995）。在酿酒工艺中，起泡性和泡沫稳定性都是评价啤酒质量的重要的标准。天然的大麦LTP1的泡沫活性很弱，但是在制麦和酿造过程中经过修饰后就会成为啤酒中很强的泡沫促进成分。因此Sørensen及其同事（1993）认为，在制麦和发酵过程中LTP1被修饰了，被修饰的LTP1对于啤酒泡沫潜力至关重要。然而据Jégou et al（1999）报道，nsLTP1的糖基化主要是由于制麦过程中发生的美拉德反应导致的。对于脂转移蛋白天然结构的热修饰、化学修饰、变性、美拉德反应的糖基化修饰和部分水解都曾先后有过报道（Asano and Hashimoto, 1980; Bech et al., 1995; Jegou et al., 2000; Jegou et al.,  2001）。Bech等（2002）通过研究认为麦汁煮沸过程中LTP1的变性导致了其内部结构的疏水区域暴露，使其泡沫性能大大提高。修饰过的LTP1在啤酒泡沫中占总量的40%，同Z-蛋白和其他蛋白的相互作用使得LTP1的泡沫性能得到增强，尤其是大麦醇溶蛋白（Lusk et al., 1995; Sheehan et al., 2000; Vaag et al., 1999）。Jégou和他的同事 （2000）通过对从大麦种子和啤酒中分离的蛋白进行比较，对制麦和发酵过程中的大麦LTP1的化学修饰进行了研究。在一种含有大麦LTP1 的蛋白组分中，借助于电喷雾质谱分析技术，他们发现了一种分子量为9689Da的主要化合物和分子量9525Da的次级峰。前者与大麦LTP1的理论分子量相同，后者与种子中由酪氨酸羧肽酶活性导致的失去了酪氨酸残基的LTP1相符合（图1- 2a）。啤酒中的LTP1组分的质谱分析显示出多个峰，然而前两个峰与大麦LTP1峰一致（图 1-2b）。其它峰的分子量相当于一个或几个单位与大约162Da分子量的加和，Jégou等（2000）说明这些加和产物同通过美拉德反应而生成的蛋白与葡萄糖单元的共价结合产物相互对应。除了糖基化，他们还研究了二硫键的断裂：一旦所有四个二硫键断裂，蛋白将变为完全去折叠形式。糖基化增加了溶解性，然而去折叠导致了通常参与疏水空穴形成的疏水性氨基酸残基的暴露。所有过程都增加了经过修饰的LTP1的两亲性，导致了其相对于天然大麦LTP1具有更高效的泡沫形成能力。

    苦味酸能够使与其作用的多肽发生变性，从而使多肽的泡沫稳定性大幅度提高（Bech，2002）。因此LTP1的变性引起其泡沫稳定性的增强可能也部分来自苦味酸的作用。已有报道 （Maeda et al., 1991; Lusk et al., 1995; Sorensen et al., 1993; Douma et al., 1998; Hejgaard, 1977; Kauffman et al., 1994） 称，分子量8–18kDa和40–43kDa的多肽集中于成品啤酒泡沫中。后来的研究表明，这些多肽都直接参与啤酒发酵过程中泡沫的产生。Bradford法能够有效的测定分子量在5KDa以上的多肽，但是对于LTP1和其他一些低分子量的多肽的测定精度却不如高分子量的多肽（Evans and Sheehan, 2002）。Kordialik和Ambroziak（2004）的电泳分析结果显示，相对于分子量在40-43KDa的主要的多肽来说，泡沫和发酵的麦汁具有非常相似的组分，分子量为5-17KDa和66KDa的多肽也很明显。在5-17KDa分子量范围的多肽中存在对应于LTP1的分子量约10KDa的多肽，分子量在5-17KDa范围的多肽可能是由大的醇溶蛋白多肽水解所产生的。
    如前所述，nsLTP1来源于大麦清蛋白。大麦清蛋白和大麦醇溶蛋白都具有啤酒泡沫活性。对于泡沫稳定性的作用来说，大麦清蛋白要比大麦醇溶蛋白更强。对这些蛋白的变性作用能够改善其疏水性并提高泡沫活性。但就一定的疏水性来说，大麦清蛋白产生的泡沫要比大麦醇溶蛋白产生的泡沫稳定，这一点可能能够反映这两种蛋白的韧性和表面弹性的差别。Jones（2005）和Zhang and Jones（1995）对 pH值在3.8、 4.8 和6.0下对采用2-D IEF×PAGE纯化的LTP1蛋白对不同绿色麦芽蛋白酶的抑制能力进行了测试：在pH3.8时，LTP1强烈抑制半胱氨酸蛋白酶，而微弱抑制一些丝氨酸蛋白酶；在pH4.8时，半胱氨酸蛋白酶被完全抑制，而丝氨酸蛋白酶被强烈抑制。麦汁丝氨酸蛋白酶的活性在pH6.0时低于正常的活性，但是在此pH值下丝氨酸蛋白酶被纯化得到的蛋白显著抑制。Davy 等（1999）发现，添加大麦LTP1到纯化的大麦半胱氨酸蛋白酶中对大麦醇溶蛋白的制备进行作用，使样品完全水解的时间从2小时增加到20小时，而对于啤酒LTP1只增加到8小时。然而，啤酒LTP1对任何蛋白酶的抑制都不具有相关性，这一点已得到反复的证实（Jones et al., 2002）。麦汁中的内切蛋白酶在70°C下的捣碎“转化”步骤中被完全失活，这一步骤要先于煮沸步骤，在煮沸过程中大麦LTP1缓慢地转化为啤酒LTP1（Bech et al., 1995），并具有泡沫活性。对于脂转移蛋白家族的另一个成员LTP2来说，它能够抑制绿色麦汁制备中存在的所有的半胱氨酸内切蛋白酶，但却对于其他的蛋白酶没有作用 （Jones and Marinac, 2000）。据Jones and Marinac（1995）报道，LTP2明显存在于成熟的谷物中，但在麦汁中却没有检测到。Garcia-Garrido等（1998）也报道称，LTP2 mRNA大量存在于成熟的谷物中，但是发芽三天后就不再有了。
6.3酵母蛋白酶Ａ对啤酒泡沫稳定性的影响
    啤酒能否具有产生良好泡沫的能力很大程度上取决于泡沫阳性蛋白的水平。含有疏水功能区域的多肽，如脂转移蛋白是啤酒泡沫的重要组成部分。尽管高浓度酿造是一种商业上可行的酿造技术，但是相比于低浓度酿造，其泡沫能力却明显偏低。通过广泛的研究已经明确，蛋白酶A能够降解泡沫稳定性蛋白，使得啤酒的泡沫性能降低。
    在泡沫阳性蛋白中，由于Z-蛋白和脂转移蛋白在酿造过程中保持相对完整，因此被认为是对啤酒泡沫稳定性贡献最大的两种蛋白，也是人们研究的重点。Evans and Hejgaard（1999）报道，大麦品种不同，会导致啤酒泡沫稳定值变化幅度达24%，由于所分析大麦中Z-蛋白及LTP1水平不同，所以该作者认为啤酒泡沫性能不同的部分原因是其麦芽中Z-蛋白及LTP1的含量不同所致。从酵母细胞中渗漏出的蛋白酶A能够水解来自于大麦的清蛋白和醇溶蛋白，并且降低其泡沫稳定性能。因此已经明确，蛋白酶A对啤酒泡沫的影响主要是通过影响啤酒泡沫阳性蛋白而起作用的。所以从蛋白酶A的角度提高啤酒泡沫稳定性的措施主要是：降低体系中蛋白酶A的含量；抑制体系中蛋白酶A的活性及保护泡沫阳性蛋白不受蛋白酶A的作用。
    酿酒酵母释放蛋白酶A的水平与酵母细胞的活力有关。酵母的活力越强，产生蛋白酶A的水平越低；相反，酵母的活力越弱，产生蛋白酶A的水平越高。因而在实际生产中，为使啤酒具有更好的泡沫性能，使用活力较高的酵母进行酿造是很必要的。另外，蛋白酶A还来自于酵母细胞的自溶。所以，在啤酒成熟后，应尽快从酒液中将酵母细胞分离去除。蛋白酶A的释放也与酵母菌种有一定的关系，高发酵度的菌株会产生较高水平的蛋白酶A。酵母在处于生长压力环境下（如氮源缺乏、代谢产物积累、高乙醇浓度、高二氧化碳浓度以及高渗透压），蛋白酶A的释放会增加。因此，生产中应该严格控制发酵条件，优化生产工艺，以减少蛋白酶A的释放。通过基因工程手段改造酿酒酵母菌株，降低其蛋白酶A的表达水平给啤酒生产者和研究者开启了一条新的思路。王肇悦（2005）通过对酿酒酵母基因组上PEP4基因进行敲除实现了酿酒酵母蛋白酶A的低表达。也可以对已经释放到体系中的蛋白酶A进行活性抑制或使其失活。这可以通过添加蛋白酶A抑制剂或高温使其失活的方法来实现。但是蛋白酶抑制剂多数是有毒的，对于啤酒生产来说不符合食品安全的要求，而通过加热失活的方法可以应用于熟啤酒生产中，但对纯生啤酒却不能适用。
7 改善啤酒泡沫的主要策略
7.1 选用优质的生产菌株和原辅料
    不同的生产菌株产生蛋白酶A的能力不同，因此选用蛋白酶A低水平的酵母菌株对于提高啤酒泡沫会有很大的帮助。原辅料对于啤酒泡沫性能具有重要的影响。因此在进行啤酒生产时，为了提高啤酒泡沫稳定性，选择优质的原辅料是非常必要的。适合生产啤酒的大麦的蛋白质含量以9%-12%为宜。原料大麦中蛋白质的含量多少，直接影响制得的麦芽的质量，而应用到啤酒酿造中的麦芽的质量直接影响到啤酒的泡沫性能。而且，如果大麦中蛋白质的含量过低将会使发酵过程中酵母的营养不足，导致啤酒的泡沫性能降低；相反如果蛋白质的含量过高，虽能保证酵母的营养和泡沫性能，但却会影响啤酒的非生物稳定性，从而缩短啤酒的保质期。使用某些谷类辅料，尤其是使用小麦作为辅料可以增进泡沫性能，这主要是由于辅料中含有较高的糖蛋白，从而促进啤酒泡沫性能的提高。
7.2 优化生产工艺
    在啤酒生产过程中，酿造工艺包括制麦、糖化、麦汁煮沸、过滤、发酵、贮酒、滤酒以及灌装等各个环节都会对啤酒的泡沫性能产生影响。因此，在实际生产过程中，应该对每一环节加以严格控制。
特别不能忽视的是蛋白质休止条件对泡沫阳性蛋白或多肽的形成起着非常重要的作用，可以作为对麦芽缺陷的补救。
7.3 使用泡沫添加剂
    使用泡沫添加剂也能够增强啤酒的泡沫性能，其中包括：（1）蛋白水解物，啤酒泡沫的主要成分是蛋白质的分解产物与葡萄糖的聚合物，泡沫中含氮物大约占56%，此外还含有一定量的酒花成分如异α-酸。因此可以把蛋白水解产物作为啤酒泡沫添加剂，对于改进啤酒泡沫的性能是可行的。如普菲柴尔，一般添加量为5-10g/kg。（2）金属盐，某些金属盐类，如镍盐和钴盐有利于增强啤酒的表面粘度，利于啤酒泡沫的持久性和挂杯性能的提高，但是由于这两种盐具有毒性并且影响啤酒的非生物稳定性，因此一般不再使用，而改用铁盐。但是铁盐用量过大时会对啤酒的口味和非生物稳定性产生不利的影响，目前市售的有奥布提蒙斯。（3）琼脂、藻朊酸及其衍生物，这类物质属于高粘度物质，容易形成强度较大的界面薄膜，使形成的泡沫不易消失，能够增强啤酒的泡持性。最常用的是藻酸丙二醇脂（PGA），但是PGA并不能够单独使用，因为它本身并不具有泡沫活性的作用，只能稳定已形成的泡沫并消除脂肪对泡沫的危害。PGA的用量一般为200PPM，加大用量并不能显著提高泡沫稳定性，在此浓度下可提高约30%的泡持性。4.阿拉伯胶。在制麦中，绿麦芽干燥前数小时喷洒阿拉伯胶，然后进行干燥，制成的麦芽能够提高啤酒的泡沫性能。

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