摘要：维生素B9（叶酸）是身体的必需维生素，它存在于食物和饮料（如啤酒）中。该实验主要研究发酵条件对酵母代谢叶酸的影响。考查参数有：酵母种类（啤酒酵母和巴氏酵母），实验室最佳条件（30℃静态麦汁）、工业生产条件（12或18℃的静态麦汁），添加催化剂（酵母缩氨酸复合体和油酸），酒精含量(4%,v/v)。结果发现，在催化剂的作用下，叶酸含量有显著提高；高酒精浓度会抑制酵母生长，降低叶酸产量；在单一的发酵条件下，不同菌种产叶酸量近似相同，所以菌种的类型对维生素的产量影响不大。
1 引言
    维生素对身体来说是十分重要的，食物中可以获取到少量的维生素，其中B族维生素有特别重要的意义。在生物有机体的氨基酸和核苷酸代谢中，叶酸是一碳单位的受体和供体。但是日常摄取量（RDV）只有300ug，在西欧国家很少超过200ug。叶酸摄取量不足，可能造成心血管疾病，贫血，细胞增殖缓慢，特别是造血干细胞，肝细胞。
    饮料、啤酒可增大日常叶酸的摄取量。不同类型的啤酒含有水、麦芽、酒花和酵母，50-250ug/L的叶酸，例如，德国啤酒平均叶酸含量50ug/L。再有发酵的啤酒在净化和过滤过程中会造成维生素含量的损失。
    在此之前的研究中，提出发酵阶段增强酵母新陈代谢，叶酸量可以提高60%。此实验研究的发酵条件对酵母产生叶酸有十分重要的影响，是发酵过程中提高叶酸生物合成的关键。影响参数有：酵母种类（啤酒酵母和巴氏酵母），实验室最佳条件（30℃静态麦汁）、工业生产条件（12或18℃静态麦汁），添加催化剂（酵母缩氨酸复合体和油酸），酒精量(4%, v/v)。
2 材料与方法
2.1 发酵条件
    酵母菌株，所有酵母菌株来自酿造和发酵部门，啤酒酵母Nos.221和Nos.284（顶部发酵酵母）和巴氏酵母Nos.353和Nos.370（底部发酵酵母）。培养基，YPD培养基（1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%琼脂）。麦汁, 购买于当地比利时啤酒厂，酿造的浓度1.06g/cm3。所有试验过程在锥形瓶中完成，Nos. 353和Nos. 370在12℃下静态发酵，Nos. 221 和Nos. 284在18℃下静态发酵（模拟工业发酵，自然空气流通）。菌株在实验室条件30℃磁力搅拌器（200 rpm）发酵。催化剂，油酸按重量添加，终浓度3.6 mg/l；YPC（酵母缩氨酸复合物）终浓度2g/l。酒精，在麦汁中添加纯酒精，终浓度4%（v/v）。
    样品取样，酵母菌在YPD培养基中培养，4℃保藏。取YPD培养基10ml，30℃下培养，接种在锥形烧瓶中（内含800ml麦汁），在660nm下检测酵母菌的生长情况，分别在接种后，对数生长期之前，对数生长期之后，平衡期四个临界期，取60ml液体（10ml测定叶酸，50ml用于其它测定），-20℃保存。
    分析程序，DMA4500，自动进样器SP1，样品前处理，4℃下5000×g离心5min，弃上清，超声波清洗器中脱气5min。
    样品提取，透析，避免沉淀，-80℃保存。酵素样品9ml，加入1ml新鲜1M，pH 7.0磷酸二氢钠缓冲液（含有10% (w/v) 抗坏血酸，0.1M的2-巯基乙醇），混合均匀后，平均分到两个无菌试管后添加1ml的HK酶，37℃下处理4h。随后样品煮沸10min，立即降温并维持低温环境，加入5ml稀释液（0.1M磷酸二氢钠缓冲液，pH7.5，含有1%（w/v）抗坏血酸和10mM 2-巯基乙醇），4℃下5000×g离心10min，取上清液，混匀，盛于1.5ml冷冻管中，-20℃储藏备用。
    叶酸分析，样品加于96孔微量滴定板上，将样品提取物分成两份，用0.1M pH6.2磷酸二氢钠缓冲液按1：200稀释，然后取50ul加于3个孔，叶酸原液 (浓度200ug/l) 加入200ul 1M NaOH和50ml 蒸馏水，溶解在20 mg的FA (F7876, Sigma–Aldrich)，用1M的HCl调至pH 7.0，加入20 ml乙醇，转移至棕色容量瓶中后100ml水，4℃下存储。
    绘制标准曲线，0-40pg/孔FA，培养液用无菌水1:4稀释后加入1ml甘油，每孔加入15ul这种液体，最后每孔加入200ul加热（37℃）后的叶酸，将微量滴定板置于37℃恒温培养箱中培养18-20h，在620nm下检测，绘制标准曲线（pg/50ul）,根据线性关系（R2>0.98）计算结果。
    结果分析，对比不同样品，发酵过程中影响叶酸含量的因素有：原料中叶酸含量（ug/l），检测出叶酸含量（ug/g）,干酵母的代谢能力（ug/hg干酵母）。每个菌株都建立光密度、干重和细胞浓度（106/ml）之间的线性关系，在发酵结束时计算酵母生物总量（g/l）。
3 结论
3.1 菌株的影响
    在酿造过程中，常用的两种酵母—啤酒酵母和巴氏酵母，啤酒酵母一种用于发酵爱尔啤酒的顶部发酵酵母，最适温度18-20℃。巴氏酵母是一种广泛用于皮尔森啤酒的底部发酵酵母，最适温度8-12℃。在研究菌株影响的实验中，四种酵母在最佳的条件（工业麦汁，30℃，温和搅拌）下代谢出叶酸。结果发现，最初叶酸集中在麦汁中(134ug/l ± 11, n=10)，原料对酵母代谢叶酸有较大的影响。

                                 图1 30℃菌株代谢图
    叶酸和酒精的产生与酵母的代谢关系密切（如图1）。由表1可以清晰的看出菌株最终产量和发酵时间，但四个菌株的叶酸产量近似相同。顶部发酵酵母（Nos.221和 Nos.284）叶酸产量略高于底部发酵酵母（Nos.353和Nos.370）。总体来说，发酵阶段叶酸量由67%增加到86%，酵母在很大程度上影响着啤酒中维生素的含量。
                                           表1 30℃菌株代谢参数表

3.2 实验条件的影响
    啤酒生产中，微生物生长的最适温度有所不同，实验室最佳发酵温度30℃，爱尔啤酒18℃，皮尔森啤酒12℃，有利于芳香族、酯类，杂醇，醛类和挥发性物质的产生，以此保证啤酒的风味。
    此外，酿造工业中，发酵罐并不是机械的搅拌，它确保酵母以最快的速度生长，发酵前圆锥形的罐体充分使冷却的麦汁与空气混合，在CO2和空气的流动下，自然生长。这也是在发酵过程检测液体上气泡的原因。
    发酵过程可以认为是酵母生长，产生酒精和叶酸的过程。表2可以看出其最终的产量。
            表2 Nos.221和284(18℃),Nos.353和370(12℃)代谢参数表

    在发酵生产中，随着发酵时间的延长，叶酸的产量逐渐下降。由图2看出发酵过程中低温、静止培养对叶酸的产生有不利影响。

   图2 工业条件Nos.221和284(18℃),Nos.353和370(12℃)与实验室条件(30℃)叶酸产量比较
3.3 催化剂的影响
    催化剂是提高酵母生长速率的化学物质，常用的有硫酸盐、氮源、无机盐、维生素和脂类，在工业生产中，催化剂可以缩短发酵时间，增加产量，保证酵母正常代谢。本实验主要研究两种催化剂，一种是参与酵母生物合成的油酸，另一种是在酵母中提取的小分子多肽类酵母缩氨酸复合物（YPC）。结果如表3，表4。图3所示，油酸和YPC的催化产量。
                              表3 工业条件添加油酸菌株代谢参数表

    两种催化剂对叶酸产量均有明显效果。油酸对缩短巴氏酵母的发酵时间有更加明显的效果，Nos.353发酵时间65h，Nos. 370发酵时间55h，叶酸产量均有明显的增长。Nos. 353较不添加催化剂提高了6h。YPC虽然没有前者明显，但是对产量提高有一定的影响，特别是顶部发酵酵母Nos. 221和Nos. 284。不仅可以缩短发酵时间，也影响叶酸含量和产生。实验发现，在叶酸代谢的不同阶段两种催化剂相互作用。

                      图3 工业条件下添加催化剂菌株代谢参数图
3.4 酒精对叶酸代谢的影响
    如果催化剂对叶酸代谢有积极的影响，那么酒精有什么影响呢？在发酵过程中酵母面临着极端温度，渗透压，养分含量，高酒精含量等问题。本实验研究酒精对其影响，确切的说，酒精浓度超过8%(v/v)，对大部分酵母有毒害作用。由于酒精是两性分子，酒精分子通过细胞膜，破坏油脂油分子层，扰乱油脂之间，油脂与蛋白质，蛋白质之间的相互作用。细胞正常的运输系统被破坏，进而影响酵母正常的新陈代谢。发酵初期酒精含量4% (v/v)，参数如表5。
          表5工业条件下酒精对菌株影响的代谢参数表

    酒精对酵母代谢有轻微的影响，对一般参数影响不大，仅减少了叶酸的终含量（如图4），麦汁中菌株减少了近30%。

                图4 工业条件下酒精对菌株代谢产量的影响
4 结过与讨论
    在啤酒中的叶酸只要是酵母产生的，该研究发现通过优化实验条件，在发酵过程中将叶酸的含量由30%提高到70%。不同菌种代谢叶酸的水平相似，啤酒酵母和巴氏酵母没有明显的区别。但不可否认的是，叶酸生成与酵母代谢密不可分。
    对比最佳实验生长条件（30℃）和工业发酵（12℃和18℃），叶酸含量略微下降。添加催化剂能提高叶酸含量，缩短发酵时间，油酸能增强叶酸在细胞膜内外的物质运输，YPC可以提高酵母的发酵能力，促进整体的新陈代谢。
酵母在酒精的作用下，代谢活动将减慢， 叶酸产量下降。酒精造成酵母营养不足，并且破坏酵母细胞形态，抑制叶酸的新陈代谢。其他营养干预的研究表明，酵母有能力在环境改变的条件下调节自身的新陈代谢。
    此外，以麦芽、谷物等原材料，低温发酵（啤酒酵母18℃，巴氏酵母12℃），添加催化剂，是提高酵母新陈代谢，产生叶酸的最佳方法。pH等胁迫因素，其他催化剂的组合，啤酒贮藏中的稳定性，发酵过程中叶酸衍生物的生成仍需要进一步研究。
    摘自：Effect of fermentation conditions of brewing yeasts on folate production[J]. Cerevisia, 36 (2011) 41–45.